1.- CONCEPTOS DE ESTERILIDAD Y ASEPSIA
En todos los ambientes abiertos se puede encontrar una gran cantidad de microorganismos
(principalmente bacterias y virus). Estos microorganismos, si tienen a su disposición
nutrientes y condiciones ambientales adecuadas pueden crecer y multiplicarse
como veremos en el próximo capítulo.
En los ambientes naturales hay mezclas complejas de muchos tipos de microorganismos
que forman poblaciones que conviven. Con objeto de poder utilizar los microorganismos
con fines aplicados y para evitar sus efectos nocivos, es necesario disponer de
métodos que permitan eliminarlos de manera que podamos conseguir ambientes limpios
sin contaminación microbiana.
Se dice que un ambiente es estéril cuando se han eliminado todos los microorganismos
del mismo. La esterilidad se puede alcanzar usando procedimientos físicos (calor,
radiaciones), químicos o mecánicos (filtración). Sin embargo, los procedimientos de
esterilización son costosos y, en ciertas ocasiones, desaconsejables. Por ejemplo, la esterilización
completa de ciertos alimentos no es posible sin destruir sus características
nutritivas.
Se dice que un ambiente es aséptico cuando se han eliminado todos los microorganismos
patógenos. Un ambiente aséptico no tiene porqué ser estéril. La asepsia también
se puede conseguir por procedimientos físicos y químicos.
2.- INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO: ANTIBIÓTICOS Y ANTISÉPTICOS.
Es necesario controlar el crecimiento de los microorganismos para poder potenciar
sus efectos beneficiosos o productivos y limitar los indeseables, contaminantes o patógenos.
Para ello se cuenta con una serie herramientas químicas y físicas.
Se denominan antibióticos aquellas substancias que interfieren el crecimiento y la
supervivencia de los microorganismos mediante una interacción específica con alguno
de sus componentes celulares. Debido a esta especificidad, los antibióticos tienen un
espectro de acción limitado; esto es, en general son activos frente a ciertos microorganismos
e inactivos frente a otros, lo que permite usarlos como agentes selectivos.
Se denominan antisépticos aquellos compuestos químicos que desarrollan su acción
letal inteaccionando de forma inespecífica con los componentes celulares de forma
que no existe una acción selectiva frente a grupos de microorganismos sino que su acción
es más general. Los antisépticos no suelen ser demasiado tóxicos y pueden aplicarse
sobre tejidos vivos.
Los diferentes tipos de microorganismos o de sus formas de desarrollo (esporas vs.
células vegetativas) tienen diferentes grados de sensibilidad a los tratamientos físicos o
químicos. Además, el uso de antibióticos supone una presión selectiva sobre las poblaciones
bacterianas que puede llevar a la substitución de las poblaciones del microorganismo
sensibles al antibiótico por otras que han desarrollado mecanismos de resistencia
frente al mismo.
ANTIBIÓTICOS
Las substancias antibióticas pueden clasificarse atendiendo a varios criterios:
1) Según su espectro de acción (tipo de microorganismos a los que afectan), los antibióticos
pueden ser activos frente a
a) Procariontes en general presentan baja toxicidad frente a los eucariontes (células
humanas) aunque hay que considerar que existen en estas ciertos orgánulos
celulares de origen procariótico que pueden verse afectados y, por consiguiente,
afectada la actividad celular general.
b) Eucariontes suelen presentar más problemas de toxicidad frente a células humanas
ya que estas son eucarióticas.
c) Ambos grupos. A ellos se aplica también el comentario del grupo anterior.
d) Antivirales son compuestos que boquean el proceso de replicación y multiplicación
vírica. Puesto que los virus son parásitos intracelulares que utilizan los
componentes celulares del huésped para su multiplicación, los antivirales son en
general tóxicos para las células eucarióticas (o procarióticas).
Los antibióticos pueden usarse de forma preventiva para evitar que en un determinado
ambiente puedan desarrollarse bacterias o microorganismos eucarióticos (hongos).
Sin embargo, el uso preventivo de antivirales no tiene sentido puesto que los virus sólo
pueden desarrollarse en el interior de una célula viva y en un ambiente sin células sólo
pueden permanecer inactivos.
2) Según su modo de acción los antibióticos pueden ser
a) Bacteriostáticos cuando causan una parada del crecimiento microbiano. Los
microorganismos no crecen en presencia del antibiótico; pero tampoco mueren
de forma inmediata. Si se elimina el antibiótico, los microorganismos pueden recuperarse
y volver a crecer. Los microorganismos cuyo crecimiento está detenido
por acción de un antibiótico bacteriostático van muriendo con el paso del
tiempo en presencia del antibiótico; sin embargo, este proceso de muerte es lento.
b) Bactericidas cuando la presencia del antibiótico produce la muerte del microorganismo
afectado rápidamente. Esta muerte puede ir acompañada de la lisis de
las células (y se habla entonces de antibiótico bacteriolítico) o no.
3) Según su sitio de acción a nivel celular, los antibióticos pueden ser:
a) Antibióticos que actúan sobre la pared celular. En general bloquean la síntesis
del peptidoglicano de manera que las bacterias pierden su protección osmótica y
lisan. Por consiguiente, son antibióticos, en general, bacteriolíticos.
i) El mecanismo de acción más común es el de impedir la incorporación de
nuevos componentes en el peptidoglicano mediante la inhibición de las enzimas
de transporte de los componentes o de síntesis de la pared celular.
ii) Estos antibióticos son activos únicamente frente a bacterias en crecimiento e
inactivos frente a esporas y a eucariontes.
iii) A este grupo pertenecen los β-lactámicos (penicilinas y cefalosporinas), la
vancomicina, etc.
b) Antibióticos que actúan sobre la membrana celular. En general su actividad se
debe a que forman poros en la membrana plasmática de forma que se rompe su
integridad, se destruyen los gradientes de iones que son necesarios para la obtención
de energía y se produce la pérdida de solutos celulares.
i) A este grupo pertenece la Nisina, antibiótico cuyo uso como aditivo alimentario
está autorizado.
ii) Hay antibióticos de este grupo que actúan sobre procariontes y otros que lo
hacen sobre eucariontes. Debido a que las membranas de los dos tipo de células
son ligeramente diferentes, los antibióticos de este grupo no suelen ser
activos simultáneamente sobre los dos tipos de células.
c) Antibióticos que actúan bloqueando la síntesis de proteínas. Son conocidos como
antibióticos ribosomales ya que actúan sobre estos orgánulos.
i) Puesto que los ribosomas procarióticos y eucarióticos son diferentes en
ciertos aspectos, existen antibióticos antibacterianos (tipo I), antieucarióticos
(tipo II) y antibióticos que actúan sobre los elementos comunes
a ambos tipos de ribosoma y, por tanto, son activos frente a procariontes y a
eucariontes (tipo III).
ii) Muchos de estos antibióticos son bacteriostáticos y su efecto es reversible si
se eliminan del medio. Otros, sin embargo, son bactericidas porque inducen
la formación de proteínas incorrectas o porque inactivan irreversioblemente
los ribosomas.
iii) A este grupo pertenecen antibióticos tales como el cloranfenicol, los aminoglicósidos,
los macrólidos
DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS
Los desinfectantes son productos químicos que matan los microorganismos y se
aplican sobre objetos inanimados, mientras que los antisépticos, por su menor toxicidad,
se emplean sobre tejidos vivos. Puesto que dependiendo de la forma como se realice
el tratamiento un mismo agente puede utilizarse como antiséptico o como desinfectante,
se suele usar el término germicida para englobar ambos conceptos.
Los desinfectantes tienen aplicación en aquellos casos en los que no se puede usar
la esterilización por calor (por ejemplo en hospitales con materiales sensibles al calor,
en instalaciones en la industria agroalimentaria, en el tratamiento de agua, etc).
En muchos casos, el tratamiento con agentes desinfectantes no elimina completamente
los microorganismos presentes, sino que simplemente se reduce mucho su número
de forma que la acción indeseable de los microorganismos se retrasa.
Las esporas bacterianas son las formas más resistentes a los antisépticos y desinfectantes
y sólo mueren al ser tratadas con agentes con alta actividad germicida. En general
las formas vegetativas de las bacterias son sensibles a todos los agentes desinfectantes,
aunque algunos grupos de microorganismos tales como las micobacterias
pueden presentar especial resistencia a los de baja actividad. Los hongos presentan, en
general, mayor resistencia que las bacterias y resisten los desinfectantes de baja actividad.
Por último, los virus presentan una sensibilidad similar a la de las bacterias, aunque
es un poco más elevada en el caso de los virus desnudos que no presentan envueltas
lipídicas.
La determinación del efecto antiséptico o desinfectante de los diferentes productos
es complicada porque este efecto depende de gran número de factores externos (temperatura,
humedad, pH, etc.) así como de los diferentes tipos de microorganismos que se
desea eliminar o controlar. Existen protocolos que regulan cómo se debe evaluar la eficacia
de un compuesto germicida y entre ellas destaca la prueba del coeficiente del
fenol (CF) en la que se toma como referencia de desinfectante el fenol y como referencia
de microorganismos Staphylococcus aureus y Salmonella typhi.
CF = dil fenol / dil desinf (Ecuación 17)
donde dil fenol es el inverso de la mayor dilución del fenol que elimina completamente
la bacteria de referencia en 10 min de tratamiento, y dil desinf es la mayor dilución del
desinfectante que elimina el microorganismo de referencia en 10 min de tratamiento
realizado el estudio de los supervivientes tras un cultivo de 48h1. el valor de CF es simplemente
indicativo ya que se trata de una medida realizada sobre cultivos puros y en la
realidad, los germicidas se usan sobre poblaciones mixtas.
Para evaluar la acción de un germicida frente a un microorganismo en particular se
realizan test de dilución similares a los realizados para los antibiogramas cualitativos o
cuantitativos.
En función de su CF, los germicidas se clasifican en de actividad alta, media o baja.
Si se desea realizar una esterilización se deberán escoger germicidas de actividad
más alta o a mayores concentraciones. Igual ocurre si en la muestra existen substancias
que protegen a los microorganismos de la acción de los germicidas (como ocurre en el
caso de la sangre o en las heces).
Principales agentes antisépticos
• Detergentes catiónicos, interaccionan con las membranas y se usan como alguicidas
en piscinas.
• Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en disolución del 6 al 30% para esterilización
en este caso), es una agente oxidante que se usa sobre la piel.
Principales agentes desinfectantes
• Sulfato de cobre, precipita las proteínas y se usa como alguicida y como antifúngico.
• Gas cloro, agente oxidante que se usa para desinfectar el agua.
• Compuestos de cloro (500-5000 mg/l), agentes oxidantes que se usan en la industria
lechera, en equipos de la industria agroalimentaria y en el tratamiento de aguas.
• Compuestos fenólicos (0.5-3%), agentes oxidantes que se usan para desinfectar
superficies.
• Detergentes catiónicos, agentes que alteran las membranas y se usan en la limpieza
del material médico y de la industria agroalimentaria
• Óxido de etileno (OE), agente alquilante que se usa en la esterilización del material
de laboratorio, material de plástico y para la desinfección de frutas.
• La esterilización se lleva a cabo en un esterilizador similar a un autoclave que
controla la concentración de óxido de etileno, la temperatura y la humedad. Se usa
una mezcla de OE al 10 - 20% con CO2 u otro gas reductor porque el OE es explosivo.
El tratamiento dura varias horas.
• Se usa también en disoluciones de 450-500 mg/l.
• El OE es muy tóxico; pero se diluye rápidamente en el aire, lo que permite su
eliminación fácil después del tratamiento.
• Ozono, agente oxidante que se usa en el tratamiento del agua de bebida.
3.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR.
Los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a temperaturas
superiores a su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para eliminar
microorganismos por termodestrucción. Los métodos basados en el calor son quizá
los más utilizados para controlar el crecimiento microbiano.
La sensibilidad de los diferentes tipos de microorganismos a los tratamientos
térmicos es distinta. Las esporas son la formas más termorresistentes y las células vegetativas
las más sensibles. Por otro lado, los microorganismos Gram-positivos tienden
a ser más resistentes que los Gram-negativos. Por consiguiente, desde un punto de vista
práctico, la esterilización por calor está destinada a matar las esporas bacterianas.
El medio en el que se encuentra un microorganismo influye en su sensibilidad al
calor. Por lo general, los microorganismos son más sensibles a las altas temperaturas
cuando se encuentran a pHs ácidos, mientras que las concentraciones altas de proteínas
o azúcares en el medio disminuyen la efectividad del calor y protegen a las bacterias.
Las altas concentraciones de sal tienen efectos variables según el tipo de microorganismo
La esterilización por calor se puede hacer en medio húmedo usando un autoclave o
en medios secos mediante el horno Pasteur.
El autoclave esteriliza usando el calor húmero transmitido por vapor de agua sobrecalentado
debido al uso de altas presiones. el efecto del vapor de agua es facilitar la
transmisión del calor al objeto en esterilización. El procedimiento usual es usar 121ºC
para lo que es necesaria una presión de 1.1 kg/cm2. En estas condiciones un tratamiento
de 15 min es suficiente para eliminar las esporas de Gram-positivos.
En un horno Pasteur se usa calor seco transmitido por el aire al objeto en esterilización.
En este caso, la temperatura más usual suele ser de 180-250ºC y el tiempo de esterilización
entre 30 min y varias horas. El uso del horno Pasteur está limitado por las
características del material a esterilizar.
Puesto que el tratamiento térmico puede alterar las características del producto tratado,
en el caso de alimentos o de productos termosensibles, se han desarrollado diferentes
tipos de tratamiento industriales entre los que destacan:
1. La Pasteurización destinada a reducir las poblaciones bacterianas. Se emplea principalmente
en el tratamiento de la leche que se hace pasar por un tubo en contacto
con la fuente de calor de forma que se incrementa la temperatura hasta 71ºC durante
15 s (tratamiento HTST) y a continuación se enfría rápidamente.
• Un procedimiento alternativo consiste en calentar a 63-66ºC durante 30 min
(tratamiento LTLT) sin embargo, este tratamiento produce mayores alteraciones
organolépticas en el producto.
2. Por último, el tratamiento UHT consiste en un proceso en flujo en el que el producto
alcanza 140-150ºC durante unos pocos segundos. Este tratamiento permite un
tiempo de conservación del producto mucho más largo (hasta 8 semanas).
4.- CINÉTICA DE MUERTE: VALORES D Y Z.
La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas
sigue una cinética exponencial. Si representamos la variación del logaritmo del
número de células supervivientes a un tratamiento térmico realizado a una temperatura
dada en función del tiempo de tratamiento, se obtiene una gráfica del descenso del logaritmo
de supervivientes es lineal con el tiempo.
La recta tiene una pendiente que permite calcular la velocidad de termodestrucción.
Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes
caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del
número de supervivientes se reduzca en una unidad). Si consideramos N0 como el número
de células al inicio del tratamiento y Nx el número de células supervivientes después
de un tratamiento de t minutos a una temperatura T, el tiempo de termodestrucción
se calcula de la siguiente manera:
(Ecuación 18)
La magnitud de D es tiempo (en muchos casos se usan los min; pero ciertos tratamientos
son tan efectivos que resulta más práctico usar los s, que, por otra parte, son
unidades del SI).
El tiempo de termodestrucción (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice
t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos
microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica.
De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr
que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor
z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para
que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial.
z = ΔT / [log (Dt1 / Dt2)] (Ecuación 19)
donde ΔT es el incremento de temperatura, y DT1 y DT2 los valores de D a las dos temperaturas
estudiadas.-
Los valores D y z varían para cada microorganismo y para cada condición. Las esporas,
por ejemplo, tienen valores D mucho más altos que las células vegetativas de los
mismos microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos, por otra
parte, suelen tener valores D más altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio.
Para poder determinar las condiciones en las que hacer un tratamiento térmico
para destruir microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores D y z.
de alimentos tales como actividades enzimáticas (por ejemplo, para la actividad
peroxidasa D120 = 0.83 x 10-3 seg y z = 27.8 ºC), actividad biológica de vitaminas (para
vitamina A D122= 2.4 x 10-3 seg , z = 23 ºC), textura de alimentos (alubias D100 = 84.9 x
10-3 seg, z = 21.3 ºC) o color (guisantes D121.1 = 1.5 x 10-3 seg, z = 39.4 ºC).3
Cuando el valor tratamiento se realiza a 121.1ºC (250ºF) al valor D se le denomina
Dr y, por tanto, representa el tiempo necesario para lograr la destrucción del 90% de las
células del microorganismo tratado a esa temperatura. Para conseguir un nivel de reducción
de la viabilidad determinado, es necesario realizar un tratamiento térmico cuya
duración depende del valor D según la siguiente ecuación
F = D x (logNi - logNf) (ecuación 20)
donde Ni y Nf representan los números de viables al inicio y al final del tratamiento,
respectivamente.
Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele requerir un tratamiento
12D de los productos susceptibles de ser portadores de gérmenes patógenos (o que puedan
dar lugar a intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12 órdenes de magnitud el
número de supervivientes o bien, visto de otra forma, reduce en un factor de 10-12 la
probabilidad de supervivencia de un microorganismo dado. Si consideramos que un
solo microorganismo contaminaba una unidad (una lata, por ejemplo) del alimento inicial,
después de un tratamiento 12D la probabilidad de encontrar una lata contaminada
se reduce hasta 10-12.
El parámetro F permite comparar el tratamiento realizado a una temperatura y durante
un tiempo determinado con un tratamiento de referencia que usemos para poder
efectuar comparaciones. Para poder comparar la eficiencia de diferentes tipos de tratamiento
térmico, se elige un sistema de referencia de eficiencia conocida. En el caso de
microbiología de alimentos, el sistema de referencia suele ser Clostridium botulinum
por ser este un microorganismo productor de intoxicaciones alimentarias graves y de
gran termorresistencia por su capacidad para formar esporas. En este caso la temperatura de tratamiento es 121.1 ºC (correspondiente a 250 ºF) y el valor z para C. botulinum
es 10.
Cuando el tratamiento de referencia es el indicado, el parámetro F se denomina F0
(= F10
121.1).
Otros tratamientos tecnológicos para destruir microorganismos (radiación, por
ejemplo) son susceptibles de tratamientos matemáticos similares a los descritos en esta
sección.
5.- LESIÓN EN LOS MICROORGANISMOS
En cualquier tratamiento antimicrobiano puede ocurrir que algunas células sean dañadas
pero no mueran. La presencia de microorganismos dañados (lesionados) plantea
un problema debido a que los métodos de detección se basan en cultivos selectivos que
en muchas ocasiones son letales para dichos microorganismos lesionados. En consecuencia,
los microorganismos dañados no son detectados y la muestra se da por no
contaminada; sin embargo, una vez que los microorganismos lesionados han reparado
sus heridas pueden volver a crecer y a producir las toxinas o causar el deterioro indeseable
en los alimentos.
Cuando puedan producirse daños en los microorganismos como consecuencia de
tratamientos es necesario considerar esta posibilidad a la hora de hacer el control de
calidad del producto haciendo un cultivo inicial en condiciones suaves en un medio no
selectivo (agua de peptona u otro medio de cultivo rico) que permita la recuperación de
las células dañadas y su posterior detección con medios selectivos.
6.- ESTERILIZACIÓN POR OTROS TRATAMIENTOS FÍSICOS
RADIACION ULTRAVIOLETA.
La radiación ultravioleta produce una disminución exponencial en el número de
células vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiación. Por tanto se pueden
calcular los valores D para la irradiación.
Existe una falta de información precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies
microbianas a la radiación U.V.: diferentes cepas de una misma especie pueden
tener una resistencia distinta.
El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. se encuentra en el saneamiento
del aire, aunque también pueden aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o
para el equipo de los manipuladores de alimentos.
RADIACION IONIZANTE.
La radiación ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para producir
efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetración es uniforme.
Es letal por destrucción de moléculas vitales de los microorganismos, esto los consigue
sin producción de calor, por lo que los alimentos se conservan frescos. La mayoría
de los daños son a nivel ADN.
La sensibilidad a la radiación de los microorganismos difiere según las especies e
incluso según las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas de una mismas
especie son generalmente lo suficientemente pequeñas para no tenerlas en cuenta a
efectos prácticos.
Las bacterias Gram-negativas son generalmente más sensibles a la irradiación que
las Gram-positivas y las esporas aún más resistentes.
En general, la resistencia a la radiación de los hongos es del mismo orden que la de
las formas vegetativas bacterianas.
Los virus son aún más resistente que las bacterias a la radiación.
7.- ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
La ersterilización por filtración se utiliza para eliminar bacterias de los medios líquidos
que sean susceptibles al calor. Por ejemplo, las disoluciones enzimáticas o de
vitaminas.
La esterilización se efectúa pasando la muestra líquida a través de un filtro con un
tamaño de poro de 0.42 μm (o menor). Las bacterias normales quedan retenidas en el
filtro y el líquido se esteriliza.
Hay que tener presente que este sistema no elimina los virus ya que estos son de
menor tamaño que el poro (virus filtrables).
8.- MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE CULTIVOS.
Existen varios métodos para la conservación de cepas interesantes de microorganismos.
Entre los más frecuentes figuran la congelación de muestras de cultivos creciendo
exponencialmente a los que se ha añadido un agente estabilizante (glicerol al
30%) y se mantienen a -80ºC; la liofilización y la conservación en medios sólidos herméticos.
La liofilización y la congelación son los métodos de conservación más efectivos a
largo plazo; pero ambos causan una gran mortandad entre las bacterias (es decir, probablemente
en torno al 80-90% de las cfu que se congelan o liofilizan mueren en el proceso).
Estos métodos son muy aplicados para conservar bacterias; sin embargo, presentan
Microbiología General
Tema 3.- Técnicas de eliminación y de conservación de microorganismos
13
más problemas en el caso de eucariontes ya que muchos de ellos no se recuperan después
del tratamiento.
Los cultivos herméticos se realizan en tubos conteniendo medio sólido que se siembran
por picadura y se cierran de forma hermética para evitar su desecación. Los cultivos
se mantienen a temperatura ambiente o en refrigeración (4ºC) y en esas condiciones
las muestras pueden sobrevivir más de un año sin que sea necesario repicar el cultivo.
Este sistema de almacenamiento sirve tanto para procariontes como para eucariontes.
Por último, el método más usado a corto plazo es el mantenimiento de cultivos sólidos
realizados en medios generales que se conservan sellados en condiciones de refrigeración
(4ºC). En este caso,. suele ser necesario realizar un repicado del material cada
cierto tiempo (entre 2 y 6 meses dependiendo del tipo de material).
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